【10×单细胞应用解析】Nature Medicine：肾脏不同组分特异性遗传变异分析确定慢性肾病的新途径

文章信息

论文标题：Renal compartment–specific genetic variation analyses identify new pathways in chronic kidney disease

刊登日期：2018年9月

发表杂志：Nature Medicine

影响因子：32.621

研究机构：宾夕法尼亚大学、迈阿密大学米勒医学院

技术手段：生信分析（WGAS、eQTL、10X Chromium单细胞转录组）、转录组测序、组织显微切割

慢性肾病（CKD，Chronic kidney disease）影响全球近10％的人口。尽管透析和移植等治疗方法取得了很大进步，但CKD仍然是世界上第九大致死疾病。 CKD发病机制的确切分子和细胞机制仍然知之甚少。因此，目前的治疗主要是姑息治疗而不是真正的治疗。据估计，美国有20％的CKD患者携带有潜在或明确的单基因致病突变，目前利用GWAS技术已经鉴定到83个与CKD显著关联的致病位点，但是遗憾的是，超过95%的突变位点位于基因组的非编码区域。GWAS一般依据与风险位点的邻近程度来筛选基因，但是调控元件可以以特定细胞类型、在很远的距离内的方式起作用，从而导致致病基因的鉴定及其调控机制变得极为困难，例如FTO（fat mass and obesity–associated）内含子区域的突变与肥胖高度关联，但是实际的原因是突变影响了FTO邻近的一个增强子，进而影响了IRX3和IRX5的表达，这表明对GWAS进行仔细，无偏差，深入的后续研究的重要性，可以更好地确认或识别特定病理状况的真正因果基因。

本研究采用显微切割技术分离了肾小球和肾小管并进行了eQTL分析，确定人类肾脏肾小球和肾小管中不同基因型驱动基因的表达变化，确定影响基因表达的变异位点。随后将该信息与GWAS整合发现，基于肾脏结构的eQTL数据显著改善了那些受突变（GWAS分析得到）调控的基因的鉴定。 此外将肾脏eQTL数据与表观基因组数据和单细胞转录组测序相结合，以研究致病突变的细胞类型特异性eQTL调节机制。 最后在动物模型中进行了细胞类型特异性基因功能研究，证明DAB2可能是CKD发展的因果基因。

文章结果

1、不同人肾脏组分eQTL

微切割技术分离人肾小球和肾小管后做转录组测序，肾小球和肾小管特异表达基因分别在两种肾脏结构中高表达。经过组织学和临床评估后，选择了121份肾小管和119份肾小球（来自于151个肾脏）用于不同肾脏组分的eQTL分析，在肾小管中鉴定到4081个eGene（受SNP调控的基因）（FDR<0.05）和389454个SNP-Gene对，在肾小球中鉴定到4913个eGene和467994个SNP-Gene对，其中肾小管特异eGene 417个，肾小球特异eGene 674个，共有eGene 3493个（下图）。

2、不同人肾脏组分eQTL富集分析

通过对不同肾脏组分以及来自GTEx的44个组织样本做meta分析，鉴定到肾小管特异eGene 589个，肾小球特异eGene 594个，与GTEx共享的eGene数量分别是7050和7090（下图左），其中新鉴定的肾小管特异性eGene显著性富集在CKD GWAS和肾小球过滤率GWAS，而肾小管-shared eGene显著富集在炎症性皮肤病和帕金森病。肾小球特异性eGene显著富集在CKD GWAS和血压GWAS（下图右）。肾特异性eQTL显著富集到肾脏相关表型，而共享的eQTL显示没有富集肾脏性状，因此证实了基于肾脏组分eQTL分析的特异性和生物学相关性。

将eQTLs与GWAS取交集发现，无论是肾小球还是肾小管特异eGene，与GWAS hits variants交集部分均为血液代谢物相关基因和IgA肾病相关基因（下图）。

3、肾脏组分eQTL与CKD GWAS联合分析鉴定肾病致病基因

作者利用已发表的83个CKD关联位点，在eQTL数据中筛选得到27个基因，通过共定位分析（使用coloc）发现大部分基因在eQTL和 CKD GWAS间共定位，以上数据表明和以前完整肾脏eQTL相比，肾脏组分eQTL能够鉴定到更多的CKD因果基因（causal gene ,27VS5），且尽管肾小管和肾小球之间存在显着的eQTL共享（π1= 0.91），但在GWAS中发现的更多因果基因来自特定肾脏组分eQTL。

4、肾脏组分eQTL富集在远端调控区且表现出细胞特异性

作者假设肾脏不同组分eQTL与CKD GWAS联合分析鉴定肾病致病基因，能够识别出给定性状的特定因果细胞（causal cell）。作者在之前获得的16个小鼠肾脏细胞亚群中分析27个基因的表达，有23个基因在16个小鼠单细胞亚群中表达，并且大部分CKD关联基因只在特定细胞类型表达，其中有9个基因在近段小管上皮细胞表达（下图）。

比较共享eQTL和组分特异eQTL发现，组分特异eQTL关联的突变离TSS更远，而共享eQTL关联的突变更多是定位在启动子区域，表明组分特异eQTL与远端调控区域突变相关（下图）。

为了检查细胞类型特异性富集是否可以解释组分特异性eGenes的识别。 作者发现肾小球特异性eGenes在足细胞显著富集表达，而肾小管特异性eGenes在小管上皮细胞显著富集表达。

为了进一步了解肾脏疾病的发病机制。作者执行了27个基因的GIANT（genome scale integrated analysis of gene network），发现肾小管特异eGenes中溶酶体功能显著富集。而结合小管特异eGenes和小球特异eGenes分析发现，自噬和线粒体降解通路也显著富集。在网络分析结果中DAB2是hub基因（下图）。

5、鉴定DAB2为肾脏疾病基因

rs11959928和CKD显著关联，DAB2和C9基因位置与rs11959928接近，但具体哪个基因受rs11959928调控未知。在全肾脏eQTL分析中，rs11959928与DAB2和C9无显著关联，但在肾脏组分eQTL分析中，肾小管eQTL中rs11959928与DAB2显著关联。

6、DAB2为肾脏疾病基因

为了确定是C9还是Dab2在肾脏疾病的发展中起作用，作者做了小鼠模型体内验证实验。C9纯合和杂合敲除小鼠表型正常，未观察到肾脏的结构或功能变化。给WT（C9^+/+）和C9^+/−鼠注射叶酸诱导肾损伤（FAN, folic acid nephropathy,叶酸肾病），WT鼠和和C9^+/−鼠的肾纤维化标志物（Fn1、Col1a1、Col3a1）的转录水平无显著差异。

作者构建了WT/Dab2^flox/+和Ksp-Cre/Dab2^flox/+模型鼠后，分别注射叶酸诱导慢性肾损伤，发现Ksp-Cre/Dab2^flox/+鼠肾纤维化标志物明显更低，且病症更轻微，另外在单侧输尿管阻塞模型中，Ksp-Cre/Dab2^flox/+鼠的间充质纤维化也更低。分离WT/Dab2^flox/+原代肾小管上皮细胞FA处理后Tgfb1（编码肿瘤生长因子TGF-β）表达升高。而TGF-β是已知的促纤维化因子。

在Dab2低表达细胞中，TGF-β诱导的 SMAD2 和SMAD3磷酸化程度降低，且JNK磷酸化程度也降低，Dab2低表达导致TGF-β诱导的纤连蛋白和胶原蛋白1表达降低，表明肾小管细胞中的Dab2可能是CKD发展的致病基因，Dab2在TGF-β诱导的促纤维化基因表达中起重要作用。

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